科研 Environ Pollut：东江表观遗传毒性的综合评价：化学分析、体外生物测定和计算机方法（国人佳作）

  科研 Environ Pollut：东江表观遗传毒性的综合评价：化学分析、体外生物测定和计算机方法（国人佳作）

  本研究探讨了华南东江地表水中持久性有机污染物（POPs）的发生、表观遗传毒性及主要有毒污染物。

  本研究探讨了华南东江地表水中持久性有机污染物（POPs）的发生、表观遗传毒性及主要有毒污染物。对来自18个地点的地表水中的多环芳烃（PAHs）、内分泌干扰化学物质（EDCs）、邻苯二甲酸酯（PAEs）和多溴二苯醚（PBDEs）等特定POPs的浓度进行了调查。∑

  PBDEs的污染水平较低。PAHs、EDCs和PAEs在旱季的浓度高于在雨季的浓度，并且由于集约化生产和较低的径流量，支流中特定的POPs负载量高于干流。此外，

  DNMT1介导的东江有机提取物表观遗传等效毒性比HDAC2和HDAC8更严重。相关性分析表明，

  图S1和S2显示了东江干湿季POPs的空间分布。旱季POPs水平高于雨季，说明雨季受暴雨影响。这是一种普遍现象，在许多其他河流中也有报道。在空间分布上，位于东江下游的采样点的POPs总浓度相比来说较高，这与深圳和东莞的城市污水排放直接相关。∑32POPs的最高浓度在S7，其次分别是雨季和旱季的4748.25 ng/L和10132.14ng/L（图S2）。检测到的∑32POPs的最低浓度分别在雨季和旱季的S9和S18（图S2）。POPs的组成特征表明，EDCs是东江最常见的污染物，其次是PAEs（图S3和S4）。EDCs和PAEs在不同的水文时期具有不一样的浓度，这主要是由于环境变量的季节变化所致。东江中EDCs、PAEs和PAHs的时空分布也不同。每个采样点的EDCs、PAEs和PAHs浓度都呈现出一致的水平，这在某种程度上预示着这些污染物的浓度波动不大。此外，整个东江采样位置的描述见表S1。许多工业区位于东江支流的制造业密集型城市（如东莞）。因此，工业废水和生活垃圾污水的排放量飞速增加，加之干流水量增加，东江支流污染日益严重。

  还探讨了PAHs以及PAEs、EDCs和PBDEs的顺序。在所有检测到的PAHs中，BaA、Chr、BbF、BkF、DahA、BaP、IchP和BghiP的浓度低于Nap、Ace、Acy、Flo、Phe、Ant、Fla和Pyr（图S5）。这可能是由于这些低分子量PAHs的水溶性较高，因此它们在河水中的浓度较高。4-NP和双酚A（BPA）是主要的EDCs，DBP是PAEs中的主要同系物（图S2和S5）。根据结果得出，4-NP和BPA的浓度与工业化水平相关，因此它们在工业区附近的水中占较大比例。东江PBDEs中主要污染物为BDE209，其浓度较低，在雨季为723.0-3796.0pg/L，在旱季为505.0-4909.0 pg/L，占PBDEs检测总量的90%以上（图S1和S6）。BDE209也是最丰富的同系物，也是其他河流中检测到的最常见的污染物。成分分析表明，EDCs是东江干湿季最主要的污染物。EDCs呈空间分布趋势，在制造业密集型城市下游（如东莞）浓度较高，而PAEs和PAHs则没有。此外，EDCs主要由4-NP和BPA组成，BPA表现出显著的季节性差异。总体而言，东江中高浓度的EDCs、PAEs和PAHs可能对水生生态和生物学产生不利影响。

  一系列体外生物测定被用于量化河水的表观遗传毒性（图2）。DNMT1介导的毒性TEQ（TEQDNMT1）在雨季为135.05-295.05 nM（平均值：216.53nM），旱季为344.94-789.44 nM（平均值：530.17 nM）（图2A和表S2）。各采样点旱季的TEQDNMT1均高于雨季（图2）。根据结果得出，表观遗传DNMT1介导的毒性在旱季大于雨季。TEQDNMT1的最高值出现在旱季的S13，达到789.44 nm（图2A）。S13（S12-S10）下游的TEQDNMT1在旱季和雨季都慢慢地减少，这可能与这些位点靠近河口的位置有关（S13 S12 S11 S10）。与阳性对照地西他滨对DNMT1活性的EC50值（200 nM）相比，旱季55.6%的样品TEQDNMT1值超过该值，而在雨季的所有样品的TEQDNMT1值均显示高于该值。数据表明东江DNA甲基化毒性严重，需引起重视。

  图2. 东江地表水表观遗传毒性等效值及分布：（A）DNMT1介导的毒性；（B）HDAC2介导的毒性；（C）HDAC8介导的毒性。

  本研究还测试了HDAC介导的毒性（TEQHDAC2和TEQHDAC8）的毒性等效浓度。TEQHDAC2在雨季为8.33-19.12 nM（平均值：12.56nM），在旱季为20.12-39.87 nM（平均值：31.03 nM）（图2B和表S2）。TEQHDAC8在雨季为1.74-3.41 nM（平均值：2.54nM），在旱季为4.45-9.98 nM（平均值：6.64nM）（图2C和表S2）。与TEQDNMT1相比，东江有机提取物的TEQHDAC2和TEQHDAC8较低，并没样品高于相应阳性对照的EC50值。同样，在旱季TEQHDAC2和 TEQHDAC8中发现了显著的季节性变化，其值比雨季高2-3倍。这证实了旱季河水的表观遗传毒性更为严重。当我们将TEQDNMT1与TEQHDAC2和TEQHDAC8作比较时，发现东江有机提取物的表观遗传效应主要是通过所有采样点的DNA甲基化介导（雨季S3除外）。这说明东江的表观遗传毒性主要体现为DNA甲基化调控过程受阻。综上所述，东江有机提取物的表观遗传毒性主要涉及DNA甲基化抑制，但HDAC2和HDAC8介导的组蛋白修饰的影响不容忽视。

  选择合适的表观遗传标记作为表征表观遗传毒性的生物指标是将表观遗传学纳入风险评估的关键。DNMT1、HDAC2和HDAC8与人类健康紧密关联，环境污染物可导致多种类型的表观遗传改变，如组蛋白甲基化/乙酰化和DNA甲基化，被认为是表观遗传毒性的潜在指标。表观遗传毒性的定量评估可能是将表观遗传机制纳入风险评估的关键步骤。钱等人基于增强型绿色荧光蛋白报告基因的体外生物测定，量化了渤海湾和淮河采集的水的表观遗传毒性，将含有增强型绿色荧光蛋白甲基化启动子的质粒转染到细胞中，然后通过表达的荧光蛋白的荧光强度报告环境基质诱导的DNA去甲基化潜力。然而，POPs诱导的DNA去甲基化潜力的报道较少，且POPs诱导的组蛋白修饰很少发生。DNA甲基化已被用于评估东江的毒性，HDAC2和HDAC8介导的组蛋白修饰是表观遗传毒性的新指标。本研究以DNMT1，HDAC2和HDAC8的活性为指标，定量分析了东江有机提取物的表观遗传毒性。研究结果将有利于比较不同表观遗传模式的毒性数据，提高表观遗传毒性作为风险评估新标志物在真实环境中的应用。

  在研究区，有更多的排放源和设施向河流排放有机污染物，如工厂、居民、烧烤、港口、公园、农业活动（表S1）。敏感性分析表明没有异常值、多重共线性或方差相关性的不当影响（表S3）。为了探索POPs负载量和表观遗传TEQ值间的潜在联系，进行了Pearson相关分析。∑16PAHs、∑6PAEs和∑6PBDEs的浓度与表观遗传TEQ间没有显著相关性（p 0.05）（表S4）。然而，在旱季和雨季都发现∑4EDCs的浓度与表观遗传TEQDNMT1和TEQHDAC2之间的相关性（p 0.05）（表S4）。此外，无论在雨季和旱季TEQDNMT1都未与任何单一检测到的PAHs显示出显著相关性（表S4）。TEQDNMT1和4-NP在雨季和旱季均呈正相关，且在旱季TEQDNMT1-BPA、TEQDNMT1-E2以及TEQDNMT1-DOP间均呈正相关（表S5-7）。对于TEQHDAC2和TEQHDAC8，发现TEQHDAC2-4-NP、TEQHDAC2-IchP、TEQHDAC2-BPA、TEQHDAC8-4-NP、TEQHDAC8-BDE47、TEQHDAC8-Pyr、TEQHDAC8-IchP和TEQHDAC8-Chr间均呈正相关（表S5和S8）。此外，发现TEQDNMT1-BDE183和TEQHDAC2-BbF间均呈负相关（表S7和S8），这可能表明这两种污染物可能有利于相应表观遗传调节剂的稳定性。TEQHDAC2和TEQHDAC8与4-NP浓度相关，这与TEQDNMT1相似（表S5）。此外，还观察到TEQ浓度和结合亲和力之间的线性相关性。根据结果得出，在TEQ值与化学品浓度总和乘以结合亲和力之间发现相关系数（R2）在0.64-0.85间，存在非常明显线）。然而，TEQ值与PBDEs与受体的结合亲和力之间没有显著相关性（图3）。这可能是由于水中的PBDEs含量低以及BDE同系物和受体之间的亲和力低。

  图3. 表观遗传毒性等效性与化学物质浓度总和乘以结合亲和力之间的线性关系：（A）PAHs；（B）EDCs；（C）PAEs；（D）PBDEs。

  几种有机污染物可以写入或擦除表观遗传标记，然后改变基因表达程序，例如POPs和EDCs。慢慢的变多的证据说明，具有表观遗传毒性作用的化学物质在环境中广泛传播，因此，开展表观遗传风险评估迫在眉睫。在我们的研究中，进行了体外生物测定，它们提供了有关环境水样提取物的表观遗传毒性信息，但很难确定主要的毒性来源。TEF表示具有相同毒性机制的化学品的相对效力，并且可能有助于估计与暴露于复杂混合物有关的风险。然而，具有表观遗传作用模式的化学污染物的TEF值仍然不足。有机物与酶的结合亲和力可以反映对酶活性的抑制程度。此外，之前的研究发现小分子的IC50值与具有相对结合亲和力的那些呈线性相关。因此，我们提议结合亲和力可当作评估化学物质表观遗传毒性的相对有效的尺度。在我们的研究中，水样提取物的TEQs与化学物质浓度之和乘以结合亲和力呈线性相关，这证实结合亲和力可能是用于表观遗传风险评估的有希望的TEF。

  在这项研究中，结合亲和力被用作评估表观遗传风险指数的主要贡献者的毒性因素。由于TEQ值和PBDEs与受体的结合亲和力之间没有线性相关性，所以下面的计算没考虑PBDEs。雨季表观遗传风险（公式三）为46329.24-90413.82（平均值：68751.92），旱季为109846.43-198479.95（平均值：157380.87）（图4）。与雨季相比，旱季的表观遗传风险平均值是雨季的两倍多，这与河流中污染物的浓度有关。DNMT1介导的表观遗传风险指数（来自公式二）与HDAC2和HDAC8介导的表观遗传风险指数（来自公式二）的比率在旱季和雨季均相似，这表明通过DNA甲基化和组蛋白修饰介导的表观遗传风险是相似的。此外，对于DNMT1介导的表观遗传毒性，EDCs的总风险百分比在雨季为48.50-73.48%，在旱季为36.21-68.82%（图5）。同样，EDCs在雨季显示出总风险的44.50-72.47%，在旱季显示出35.36-67.66%，其毒性由HADC2介导的。HDAC8介导的毒性风险在雨季为43.35-72.06%，旱季为33.89-66.01%（图5）。根据结果得出，EDCs的化学物质是表观遗传风险的主要贡献者，且雨季风险高于旱季。因此，EDCs能够最终靠改变DNA甲基化和组蛋白修饰来修饰表观遗传，这在某种程度上预示着我们应该更加关注这些污染物。

  图5. EDCs诱导东江地表水表观遗传风险指数（ERI）分布及贡献分布：（A-B）DNMT1相关的表观遗传风险；（C-D）HDAC2相关的表观遗传风险；（E-F）HDAC8相关的表观遗传风险。

  在东江，DNMT1介导的毒性总表观遗传风险（来自公式二）在雨季为22275.34±4364.58，在旱季为52382.39±9592.15，仍比雨季高出近两倍。能得出结论，DNMT1介导的东江表观遗传风险排序为：EDCs PAEs PAHs（图4）。EDCs是最主要的污染物，主要与性激素受体结合，研究人员早在1997年就证明了它们的表观遗传机制。在旱季，除某些采样点外，在其他采样中计算的DNMT1介导的表观遗传风险表明EDCs占总表观遗传风险的50%以上，这与在雨季相似（除了S9和S16）。我们还观察到，与其他采样点相比，S7的总表观遗传风险最高，并且与EDC相关的表观遗传风险也很高。我们得知4-NP和BPA是EDCs污染物中表观遗传风险的最大贡献者，是污染物对人类健康产生不利影响的主要风险（图5）。根据结果得出，表观遗传风险比可当作效益指标，表明单个样品中所有污染物的毒性百分比。研究表明，即使在低（皮摩尔）浓度下，BPA也能影响细胞或组织的正常生理功能。此外，BPA暴露不仅会导致女性卵泡和黄体细胞的缺乏，还会导致新生儿某些基因的低甲基化，从而改变其表达。因此，包括4-NP和BPA在内的EDCs可以显著改变DNA甲基化水平，这些都是要关注的新兴污染物。

  在东江，HDAC2介导的毒性总风险在雨季为15659.5-29806.3，旱季为36588.9-65237.5，HDAC2介导的毒性分布与DNMT1介导的毒性分布相似（图4）。位点S3有排水管网汇合，在雨季HDAC2介导的风险值最高，而旱季HDAC2介导的风险值最高的是S7，这可能与工业区中心位置有关。EDCs在HDAC2介导的总风险中所占比例最高，雨季为44.5%-72.0%，旱季为39.7%-67.7%（图4）。与DNMT1介导的毒性相似，无论是在雨季还是旱季，4-NP和BPA都是这些EDC污染物中HDAC2介导的风险的最大贡献者（图5）。先前的动物研究表明，BPA会降低HDAC2活性并改变H3K9、H3K27和H4K12的乙酰化模式。而且，组蛋白的乙酰化模式还与情绪的调节有关，进而影响学习和记忆的过程。PAEs还占总HDAC2介导风险的很大比例，尤其是那些源自DBP的值，占PAEs诱导的总HDAC2介导风险的50%以上（图S7）。此外，DMP、DEP、DOP、DEHP和BBP也是HDAC2介导的表观遗传风险的重要贡献者。研究表明，即使是低水平的产前BBP暴露也会增加后代肥胖的风险，因为BBP增加了干细胞中脂肪生成的潜力。因此，除了EDCs外，不应低估PAEs的表观遗传毒性。

  与HDAC2类似，HDAC8涉及表观遗传毒性的总风险，即对组蛋白修饰模式风险的调节。与DNMT1和HDAC2介导的表观遗传风险相比，HDAC8介导的表观遗传风险更高，但没有显示明显的季节性差异。PAHs、PAEs和EDCs对HDAC8介导的表观遗传风险的贡献趋势与DNMT1和HDAC2介导的风险一致（图5）。同样，EDCs不仅是表观遗传风险的主要贡献者，而且在所有采样点的污染物浓度也是最高的。与HDAC2和DNMT1贡献的相比，EDCs贡献的表观遗传风险比例降低（雨季为43.3%-71.7%，旱季为33.9%-67.0%）（图5）。在所有的PAEs中，DBP显示出最高的HDAC8介导的表观遗传风险，这与显示HDAC2和DNMT1的表观遗传风险的PAEs一致。PAHs也是HDAC8介导的表观遗传总风险的重要贡献者（图S8）。水的毒性可能是水质和安全评估的关键特征，其数据大多数来源于对藻类、大型水蚤和斑马鱼等水生生物的体内生物测定以及体外生物测定。这一些方法可以提供有关水中污染物不利影响的信息，但是，体外生物测定方法不容易开发，且没办法提供每种污染物的贡献度。根据结果得出，与EC50紧密关联的结合亲和力是评估表观遗传风险的重要的因素的有用毒性因素。因此，在检测到目标污染物的浓度后，我们根据浓度×结合亲和力的值评估了主要的表观遗传风险因素。我们应用通过污染物和参与表观遗传调控的相关蛋白质的分子对接获得的结合亲和力作为毒性因子来评估每种污染物对表观遗传风险的贡献。该毒性因子将污染物的浓度与其对酶活性的抑制作用相关联，可用于直接评估环境基质中污染物的表观遗传毒性的权重。然而，本研究仅分析了水样中的PAHs、PBDEs、PAEs和EDCs四种化合物，可能忽略了水样中可能会引起表观遗传毒性作用的其他一些化合物。尚不清楚这些化合物是否也能应用结合亲和力作为毒性等效因子。所以这个假设确实受到一些不确定性的影响。

  在这项工作中，通过定量评估东江的表观遗传毒性，将表观遗传调控机制（DNMT1-、HDAC2-、HDAC8-介导）纳入风险评估，检测了东江POPs浓度，并且得出结论：PAHs（Nap、Ace、Acy、Flo、Phe、Ant、Fla和Pyr）、PAEs（DMP、DEP、DBP、DEHP和BBP）和EDCs（4-NP、BPA）是主要污染物。与HDAC2和HDAC8相比，东江中有机提取物的表观遗传毒性主要体现在生物体内DNMT1活性的抑制，这可能会阻碍DNMT1介导的调控。此外，有必要使用具有不一样作用模式的多种标记进行表观遗传毒性评估。有机提取物的表观遗传毒性和POPs（PAHs、PAEs和EDCs）的浓度，以及有机提取物的表观遗传毒性和表观遗传风险（浓度×结合亲和力）之间有显著相关性。POPs与表观遗传受体之间的结合亲和力可以被视为表观遗传风险表征的毒性等效因素。BPA和4-NP是表观遗传风险的最大贡献者，并且PAEs和PAHs的表观遗传风险也不容忽视。